病原菌的氢气代谢

病原体是能导致疾病的微生物，研究表明，病原菌普遍存在氢气的代谢，而且这种代谢和病原菌的治病能力相关。探讨这个问题可能会引起研究和使用氢气的人一些疑惑甚至担忧。但是我们使用任何工具，首先应该对这些工具有全面的了解，要了解其正面信息，也必需了解其负面信息。我们绝对不能认为氢气对人安全，有充分的证据，就忽视氢气对人存在的潜在风险。例如氢气和致病菌的关系，我们应该认真对待。

当然也不必过于担心。根据这方面研究者的普遍观点，认为氢气在身体内的浓度比较高，已经完全满足这些细菌的需要，即使补充也不会再进一步增加其治病能力。我对这个说法比较担心的是，引用的证据是学者们对小鼠的测定结果。而来自人体呼吸气氢气浓度的检测结果提示，人体内氢气的平衡浓度非常低，甚至有一些人检测不到。那么这提示氢气并不能满足这些致病菌的需要。增加氢气的供应有可能会增加其治病能力。不过好消息是，人体内细菌不只有致病菌，更多的是对人体有好处的益生菌。这些益生菌同样也代谢氢气。且其重要性不亚于对致病菌的意义。对于健康人或基本健康的亚健康者。氢气对致病菌和益生菌的作用基本上是等价的。而由于益生菌的地位相对超过致病菌，那么最终的结果是有利于宿主。如果你实在不放心，就适当补充益生菌。那就更完美了不是。

病原体可以通过各种各样的机制来保存能量。许多细胞主要通过呼吸作用保存能量，其中电子转移产生质子动力(PMF)，使ATP通过氧化磷酸化合成。各种电子供体(如NADH、琥珀酸、甲酸和氢气)和电子受体(如氧气、富马酸、硝酸盐和亚硝酸盐)已被证明支持它们的呼吸(1)。其他病原体主要采用发酵生活方式，其中有机碳不完全氧化，ATP通过底物水平的磷酸化合成。这导致了有机和无机最终产物的生产，例如，醋酸盐、丁酸盐、氢气和二氧化碳。研究病原体的生物能量学对于解决病原体如何在宿主组织和其他宿主中生长和生存至关重要。因此，生物能量学已经成为一个很有前途的研究领域，而针对这一特定领域的新抗生素最近甚至被批准(1,3)。病原体的氢气代谢是一个特别重要但相对探索不足的领域。

氢气是病原体理想的呼吸能量来源有两个原因。首先，反映其高度负的标准氧化还原电位(?mV)(2)，其氧化是高度放能的，可以与所有主要生理电子受体的还原相耦合(4)。其次，这种可扩散气体在宿主组织中大量存在，是结肠菌群发酵产氢气的结果(5-7)。

在小鼠的小肠中氢气的浓度为~μM，胃中氢气的浓度为~43μM(8,9)，在人类中预测的水平相似(5)。这一量远远超过了大多数病原体对氢气的表观亲和性(表观Km,1.8~2.5μM)(8-10)；因此，我们认为病原菌在宿主组织中饱和氢气(11)。遗传研究表明，几种主要人类病原体的毒力取决于氢气氧化，特别是幽门螺杆菌(9)，空肠弯曲杆菌(12)和沙门氏菌血清鼠伤寒(8,13)。这些生物利用一种被称为氢化酶的特殊酶将氢气异裂为电子和质子；衍生的质子有助于产生PMF，而电子进入有氧或无氧呼吸链。虽然这些细菌主要以异养方式吸收碳(1)，但它们通过氢气氧化释放能量的能力使它们在胃肠道定植期间具有关键的竞争优势(9,13)。此外，我们假设氢气代谢赋予的灵活性有助于病原体在不同的宿主组织和环境水库中持续存在。

厌氧菌产生氢气能代替氧化底物。许多细菌和原生病原体也会在缺氧环境中产生氢气。这种可扩散气体的产生为处理还原剂提供了一种有效途径。这在胃肠道等环境中尤其有益，因为可发酵可用性碳源通常超过呼吸电子受体(14)。专性厌氧菌如产气荚膜梭菌(15)和阴道毛滴虫(16)可以通过产氢发酵高效生长。相比之下，兼性厌氧菌，如大肠杆菌(17)和贾第鞭毛虫(18)产生氢气作为一种策略来生存电子受体限制。根据不同的生物体，氢化酶氧化甲酸、NADH和碳水化合物氧化过程中产生的还原铁氧还蛋白，并利用衍生的电子将质子还原为氢气(15,17,19,20)。

微生物广泛调节其氢气代谢途径以适应环境变化(21)。一些代谢特别灵活的细菌，如鼠伤寒杆菌和大肠杆菌，甚至可以根据资源的可用性在氢气的净生产和消耗之间切换(22,23)。在人体或动物体内的环境中，氢气的可得性极有可能是一个决定因素，可影响人体微生物群的组成和分布，进而对发病机制产生重大影响。

在这些原则的基础上，以下章节提供了病原体中氢气代谢的全面评估。我们利用基因组调查证明，氢气代谢的决定因素在病原体中广泛存在，并普遍分布于胃肠道细菌中。在整个综述中，每个氢化酶数据库(HydDB)(24)系统使用氢化酶的类别和基因名称；该系统根据氢酶的主要序列预测氢酶的结构(如亚基组成)和功能(如氢气-氧化与氢气-演化)特征。随后，我们探索了氢气在特定病原体中的代谢基础、作用和重要性。回顾过去和现在的文献，许多综述集中在弯曲杆菌(幽门螺杆菌、空肠弯曲杆菌和简明弯曲杆菌)、肠杆菌(大肠杆菌、鼠伤寒杆菌和福氏志贺氏杆菌)和梭状芽胞杆菌(产气荚膜杆菌和艰难梭状芽胞杆菌)中的研究。本文还总结了其他已建立和新出现的病原体中氢气代谢的知识，包括由原生寄生虫产生氢气。还考虑了氢气-代谢病原体和微生物群之间的代谢相互作用如何影响感染，同时承认在这一领域还需要大量的进一步研究。整合这些发现，我们评估通过未来开发小分子抑制剂或操纵微生物群来抑制病原体氢气代谢的利弊。

氢代谢和氢化酶

生物化学：病原体中两种不同的氢化酶

氢酶是微生物中催化氧化和产生氢气的酶。它们催化最基本的化学反应:

尽管这个反应表面上很简单，但氢化酶的结构和机制却非常复杂。这反映了一个事实，即在细胞条件下，氢气的氧化在热力学上有利，但在动力学上具有挑战性。此外，需要复杂的酶机制来利用从这种氧化中获得的电子和质子进行化学渗透，即产生离子梯度的过程(4)。细菌使用两种不同类型的氢酶来克服这些挑战，[NiFe]-氢酶和[FeFe]-氢酶，这两种酶都存在于病原体中(25,26)。在一个显著的趋同进化的例子，这些氢化酶表现出结构和机制的相似性，尽管他们的系统发育起源不同。在最近的一篇综述中(27)详细介绍了两种氢酶的双金属中心配合氢气并催化其杂解裂解(通过在碱的存在下增加其酸性)，从而释放出一个质子(H+)和一个氢化物阴离子(H-)（氢负离子）。质子最初被与催化中心(28,29)相关的碱所接受，随后通过一系列氨基酸(28,30,31)转移到水外。相反，氢化物阴离子上的两个电子(28,32)通过铁硫团簇传递到下游受体(例如，呼吸细胞色素)，由此产生的质子也从酶中释放出来(25,26)。这个反应是可逆的，许多氢酶主要催化质子还原为二氢(4)。最终，氢酶的方向性是由它们内在的氧化还原化学(即催化偏置)和它们与外部电子给体或受体的耦合决定的(33-35)。

[NiFe]-氢化酶是细菌中广泛存在的酶(36)。它们广泛分布在有氧和厌氧病原体中，已被证明在幽门螺旋杆菌(9)、空肠弯曲菌(12)和鼠伤寒沙门氏菌(8)的发病机制中具有关键作用。由于广泛的生化、结构、光谱和电化学研究，这些酶已被相对理解(4,27)。如图1a所示，这些酶的大亚基与由两个CN，一个CO和四个半胱氨酸配体连接的镍-铁催化中心结合(25)。双原子配体(CN和CO)通过调节这两种金属在该位点的氧化还原化学，促进氢气的解离(28)。所有的[NiFe]氢化酶也包含一个小亚基，包含三个铁硫簇(36)；根据酶的方向，电子通过这些簇在活性位点和生理电子给体或受体之间转移(25,37)。如下面所述，这些氢化酶在特征方面具有巨大的多样性，如催化参数、亚基组成和氧化还原伙伴(25,37-43)。这使得它们能够在细菌呼吸和发酵等过程中发挥一系列作用(4,36)。

虽然[NiFe]-氢化酶的活性位点通常会被氧抑制，但已经发现了各种类型的酶在环境条件下发挥作用，其中一些支持有氧呼吸(36,44,45)。正如几项独立研究(37,39-41,44)所述，几种机制使这些酶能够从活性位点排除或清除氧气。

[FeFe]-氢化酶通常与专性厌氧菌相关(36,46,47)。它们分布在许多发酵性细菌病原体中(如产气荚膜梭菌)(15)，也被许多原生生物物种获得(如阴道毛滴虫)(47)。基于结构研究(图1b)，这类氢化酶的主要成分是一个结合催化辅助因子(H簇)的保守核心结构域和一个结合2到4个铁硫簇的可变C端结构域。二铁催化中心由两个CN配体、三个CO配体、氮二硫代桥接体和通过桥接半胱氨酸连接的[4Fe4S]铁簇连接(26,29,48)。该位点介导了氢气的杂解裂解，氢化物结合在金属中心，质子被氮杂二硫代氮接受(29,32)。[FeFe]-氢酶通常催化倾向于氢气的产生，通常使用还原的铁氧还蛋白作为它们的电子供体；鉴于其非常高的周转率(~10,s?1)，它们特别适合专性发酵罐，如梭状芽孢杆菌(49)。

然而，许多细菌也编码三聚体[FeFe]-加氢酶，可可逆地将从氢气电子分叉给铁氧还蛋白(20,50,51)。几种呼吸吸收[FeFe]-加氢酶也已被鉴定，特别是硫酸盐还原菌中起快速作用的浆周加氢酶(48,52)。与[NiFe]-氢化酶相比，[FeFe]-氢化酶通常只在缺氧条件下发挥作用，并且在氧气暴露时受到不可逆的损伤(53,54)。

对于这两种类型的氢化酶，氢气结合位点是由特殊配体协调的金属离子组成的复杂结构。这些都是通过专门的途径合成的。[NiFe]-氢化酶的成熟是一个多阶段的过程，需要至少七个因子(HypA,HypB,HypC,HypD,HypE,HypF和HupD)的协同活性(55-57)。

最近，[FeFe]-氢化酶的成熟途径在很大程度上已经被解决，涉及三个关键酶(HydE,HydF和HydG)(33,58,59)。这些酶成熟的细节超出了本文的讨论范围，已经在其他地方进行了广泛的讨论(27,33,56)。其他蛋白质对于氢化酶的功能也是必需的，包括那些参与镍和铁的运输、铁硫团簇的生物合成以及氢化酶向不同细胞间室转移的蛋白质(60和61)。

病原体氢气代谢的整合与调控

病原菌在广泛的生理环境中使用氢化酶。如表1所示，[NiFe]-和[FeFe]-氢化酶在功能和系统发育上都广泛分化为多种不同的类群。这些群体在关键特征上存在差异，如催化行为、遗传组织、氧化还原伙伴、细胞定位和氧耐受性。已知病原体中至少有13个[NiFe]-氢化酶亚基和5个[FeFe]-氢化酶亚基。

通过在生长过程中利用分子氢作为能量来源的氢营养生长的病原体，可通过耦合氢气的氧化，并还原呼吸电子受体，如氧气或富马酸盐(1)来实现。这取决于跨细胞膜产生PMF来产生质子梯度，从而通过F1F0-ATP酶(即氧化磷酸化)激活ATP合成；PMF为质子易位产生的两个组分，分别是pH梯度(ΔpH；H+在膜上的浓度差)和膜电位(Δψ；跨膜的电势差)(62)。大多数氢营养病原菌使用膜结合的、质周定向的氢化酶来催化氢气氧化(即1b、1c和1d[NiFe]-氢化酶)。氢气氧化产生的质周质子直接促进了PMF的生成。同时，释放的低电位(氧化还原电位)电子通过呼吸链转移到末端电子受体(4,63)。已知有几种末端电子受体支持病原菌的氢营养呼吸作用，包括氧气(如幽门螺杆菌)(64)、富马酸盐(如鼠伤害杆菌)(13)、硝酸盐(如直肠弯曲菌)(65)和亚硫酸盐(如沃氏嗜胆菌)(66)。依赖于呼吸链的组成部分，电子流通过矢量(即直接泵送)或标量(即氧化还原环)机制激活质子从胞浆转位到周质(67)。如下文所述，某些病原体也依赖氢气氧化来介导碳固定(68-70)，并为需要的过程提供能量，如底物摄取(71-73)、蛋白质分泌(74)和群集运动(75)。

同样重要的作用是，氢酶在发酵过程中以氢气的形式耗散还原剂。在这一过程中，碳水化合物不完全氧化为有机和气态终产物所获得的能量通过底物水平的磷酸化作用产生ATP(2)。这一过程维持了梭状芽孢杆菌和毛滴虫等专性发酵病原体的生长。在这些生物中，胞质[FeFe]-氢化酶(A1,A3和B亚型)介导碳分解过程中还原的铁氧还蛋白和烟酰胺的再氧化(35,46）；一些原生生物，如阴道滴虫，在被称为氢化酶体的特殊细胞器中实现这一过程(16,76)。在兼性发酵如大肠杆菌(77)和简明弯曲菌(78)中有一个独特的系统。据认为，这些细菌转换到利用发酵来生存，它们的呼吸电子供体不足。它们使用特殊的膜结合的、潜在的离子动力复合物(甲酸氢裂解酶含有4a[NiFe]基团-氢酶)将发酵产物甲酸酯分解为氢气和二氧化碳(17)。这一过程被认为能维持氧化还原稳态，调节细胞质pH值，并可能产生PMF(23,79)。

一般来说，氢气的代谢是受到严格调控的。一些专性发酵病原体被认为在其整个生命周期中产生氢气，因此需要持续合成其氢化酶。然而，对于大多数其他细菌来说，氢气代谢是一种随细胞和环境线索而诱导的特性(4)。这方面的一个很好的例子是鼠伤寒沙门氏菌产生多种氢化酶。该细菌在三种主要的氢气代谢模式之间切换，每种模式都由不同的氢化酶介导(80,81):(i)通过有氧氢营养呼吸生长(1d[NiFe]-氢化酶)(82)；(ii)厌氧氢营养呼吸生长(1c[NiFe]-氢化酶)(83)；(iii)持久性氢发酵(4a[NiFe]-氢化酶)(84)。鼠伤寒杆菌通过感知外源电子受体水平来分级调控三种氢化酶。这使得ATP生成相对于资源可用性最大化。有人提出，这种灵活性允许细菌在缺乏氧化剂的环境中持续存在，并在呼吸电子受体可用时迅速入侵宿主组织(23)。

控制氢气代谢的基因通常聚集在一起，使其协调表达。一个简单的例子是空肠弯曲杆菌的hyn和hyp操纵子。该病原菌的hyn操纵子(hynABCD)编码其1b[NiFe]-氢化酶的三个结构亚基和一个成熟内肽酶。第二个操纵子hyp(hypFBCDEA)编码合成[NiFe]辅因子所需的6个蛋白质(12,85)。这两个操纵子都是在感染过程中诱导的，成熟基因的表达水平低于结构基因(86)。一系列的激活子和抑制子可以结合氢化酶操纵子的启动子来响应内外信号。事实上，各种信号和调控因子已被证明在不同细菌中控制氢化酶操纵子的表达，包括氧化还原状态(如ArcA)(87)、氧水平(如FNR)(88)、能量可利用性(如CRP)(89)、金属可利用性(如Fur和NikR)(90)和发育阶段(如Spo0A)(91)。这一调控的细胞和分子基础在其他地方详述(4,21,23)。一些环境生物也会调节氢酶基因的表达以响应氢分压，但这与大多数病原体的相关性较小，因为氢气通常在宿主组织中大量存在(21)。

氢气代谢病原菌对胃肠道菌群的破坏

越来越明显的是，许多病原体，特别是胃肠道(胃肠道)的病原体，并不是孤立作用的。它们的发病机制通常涉及与非致病性微生物群的代谢相互作用，包括氢气交换(92)。胃肠道微生物群通常通过一系列机制来抵御肠道病原体的定植；例如，对能源的竞争性排斥已得到充分的记录(93,94)。然而，许多病原体善于破坏菌群，为其扩张获取资源。鼠伤寒杆菌就是最好的例子，它利用复杂的机制在肠道入侵过程中获得呼吸电子受体，包括来自宿主和其他微生物细胞的受体(96,95)。由于抗生素治疗、饮食因素和炎症条件导致的胃肠道微生物群及其相关代谢受损，往往与病原体入侵的易感性增加有关。例如，病原体经常通过利用微生物裂解释放的微生物源性糖来引起抗生素诱导的腹泻(96,97)。也有人认为，病原体可以协调重塑微生物群，使其达到有利于其生长或持久的非生物状态(98)。虽然这些概念的研究主要涉及碳源获取，但它们也与了解氢气代谢细菌的发病机制有关。

对于氢营养病原菌来说，底物的可利用性受胃肠道中氢气代谢的动力学和生态学的控制(图2)。尽管最近人们对微生物群很感兴趣，但对控制氢气循环的过程和生物知之甚少(6,7,99)。基因组和宏基因组研究表明，大多数胃肠道微生物可以代谢氢气，包括所有五个优势门的成员(拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和疣微菌门)(7)。据认为，大多数氢气是由碳水化合物发酵的梭状芽孢杆菌和潜在的拟杆菌通过铁氧还原蛋白依赖和电子分叉[FeFe]-氢化酶产生的(7,,)。虽然产生的氢气部分通过呼吸和放屁排出，但大部分是由结肠内的氢营养微生物再氧化的(5,)。众所周知，人类结肠中有氢营养的乙酸菌、硫酸盐还原菌和富马酸还原菌，以及产甲烷的古菌。这些细菌分别产生乙酸酯、硫化氢、琥珀酸盐和甲烷的最终产物(7,-)(图2)。这些微生物的存在、丰度和活性在个体之间存在很大差异(,,)。例如，在氢营养生长过程中，肠道呼吸道细菌因其与底物亲和力高、生长产量高而胜过产甲烷菌和产丙酮菌(,)。然而，人们认为细菌的生长常常受到呼吸电子受体的低可用性的限制；因此，这些细菌很少成为菌群的优势成员()。这些因素可能解释了为什么在人类胃肠道中多个氢营养类群通常共存(7,)。

然而，人们认为氢的可利用性一般不会限制氢营养病原体的生长。在活体麻醉小鼠的微型传感器研究中，在肠道中检测到高水平的溶解氢气(μM)(8)。由于从结肠扩散，氢气在病原体定植的其他器官中也大量存在，如胃(43μM)、肝脏(43μM)和脾脏(55μM)(9,10)（这种氢气5-10%的饱和浓度非常可疑，需要认真研究。跨器官扩散不应该是主要方式，血液转移也不应该有这么高浓度）。虽然还没有在人体中进行类似的测量，但各种证据表明氢气在体内的浓度同样很高(5,)(图3)。小鼠体内氢气氧化氢酶的浓度比各种病原体中氢气氧化氢酶的表观Km(1.8-2.5μM)的浓度高20-80倍(8-10)。据我们所知，没有研究调查底物之间的竞争病原和共生的氢营养微生物。根据热力学理论，由于病原体可以垄断底物的饱和水平，并可以通过氢营养呼吸作用产生大量ATP，因此它们很可能比其他微生物群更具竞争力(23,61)。然而，如上所述，对其他资源(电子受体)的限制可能会限制它们的生长。可以产生呼吸电子受体的氢营养菌，例如，沙门氏菌(13)和弯曲杆菌()，它们可以通过三羧酸和尿素循环产生富马酸盐，因此，在富含氢气、氧化剂有限的胃肠道环境中可能特别具有竞争力。一般认为，病原体从整体溶解池中获得氢气，尽管氢气在组织中的浓度可能会出现局部变化和胃肠道。因此，一些病原体可能与产氢发酵发生特定的相互作用，从而促进种间的氢转移，正如先前对某些产甲烷菌()和硫酸盐还原剂()所描述的那样。

相比之下，发酵病原体在富含氢气的宿主组织中面临着一个主要的热力学挑战。考虑到勒夏特列原理，只有在持续去除氢气的情况下，氢气的产生才会保持有利(2)。（勒夏特列原理（LeChateliersprinciple），又名化学平衡移动原理，由法国化学家勒夏特列于年发现。是一个定性预测化学平衡点的原理，其具体内容为：如果改变可逆反应的条件（如浓度、压强、温度等），化学平衡就被破坏，并向减弱这种改变的方向移动。）

因此，细菌和真核发酵病原体可能受益于直接或间接的与氢营养微生物群的代谢相互作用，使局部氢气浓度保持在阈值以下，从而促进其他热力学上不利的反应。一些病原体已经进化出回收内源性产生的氢气的机制，例如沙门氏菌(22)。尽管如此，有证据表明，即使在气体浓度很高的情况下，几种病原体也能迅速产生氢气。例如，在体外和体内的产气荚膜梭菌生长过程中，氢可以达到毫摩尔浓度()。可以想象，一些病原体改造其发酵途径，以在氢气的高分压下维持氢气的产生，尽管会减少ATP的合成。以糖分解瘤胃细菌白色瘤胃球菌为例，它通过感知和响应氢气分压(51,)，在低pH2(产生4个ATP)时使用电子分岔氢酶，在高pH2(产生3.3个ATP)时使用依赖铁氧还原酶的氢酶。类似的代谢重塑可以解释为什么大多数产氢病原体，包括产气荚膜梭菌、艰难梭菌和阴道滴虫编码多种氢化酶(36,)。

氢气代谢是病原菌普遍存在的特征

我们进行了全面的基因组调查和文献检索，以更广泛地了解氢气代谢在病原体中的分布。个被调查的病原体基因组中含有一种或多种氢化酶催化亚基。有发表的来自细胞或生化研究的实验证据表明，这些物种中至少有46种可以消耗或产生氢气。表2报告了这些发现。图4还提供了关键病原体的[NiFe]-加氢酶和[FeFe]-加氢酶的系统发育树。

氢化酶阳性病原体在它们的分类隶属关系、它们的目标宿主组织和更广泛的代谢特征方面具有高度多样性。氢化酶是已知在胃肠道定植的细菌和原生生物病原体的普遍特征，但它们也存在于靶向其他生态位的病原体中(图3)。本文接下来的两个部分将进一步深入研究参考病原体的氢气代谢。除了那些至少部分具有氢气代谢特征的细菌病原体外，许多细菌病原体也有氢酶基因，但至少就我们目前的知识而言，它们还没有关于氢气代谢的研究。其中包括主要病原体白喉棒状杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌和毛短螺旋菌。此外，关于厌氧细菌病原体的文献也明显缺乏，尤其是螺旋菌门、梭菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，这些门经常被认为发生氢气代谢，但很少被测量或研究。

根据调查，也有许多主要病原体缺乏氢化酶。其中包括大多数采用细胞内生活方式的病原体，特别是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、沙眼衣原体和立克次体，它们的基因组减少，从而限制了代谢灵活性。主要病原体，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、单核增生李斯特菌、炭疽杆菌、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎奈瑟菌和肺炎支原体，也不存在氢化酶。这些物种缺乏氢化酶的原因尚不清楚。然而，值得注意的是，其中一些会入侵生态位，如人体呼吸道黏膜、表皮或大脑，这些地方氢气水平可能比人体其他部位更缺乏(图3)。在真核生物中，在致病真菌、锥虫、复杂蜂和蠕虫的基因组中，氢酶基因是缺失的。需要指出的是，我们没有纳入厌氧病原体中氢化酶活性的大规模研究结果，因为它可能不可靠()；用于检测氢化酶活性的分析是非特异性的，在几种不编码氢化酶的生物(如金黄色葡萄球菌)中已经检测到潜在的假阳性活性。在接下来的章节中，我们将重点

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